Typischerweise werden Tumore mit Gewebebiopsien untersucht. Eine kleine Probe wird vom Tumor entnommen und genotypisiert oder auf genetische Veranlagung analysiert. Das Problem bei diesem Ansatz ist, dass das Biopsieren von Tumoren eine Herausforderung darstellen kann. Außerdem bietet eine Tumorbiopsie nur eine Momentaufnahme des Tumors.
Im Jahr 2015 haben Labgaa und Mitautoren Discovery Medicine state über konventionelle Tumorbiopsie geschrieben: Aus offensichtlichen Gründen ist es schwierig, die Tumorentwicklung durch sequenzielle Biopsien zu überwachen. Außerdem spiegelt die Biopsie nur einen einzelnen Punkt des Tumors wider und repräsentiert daher wahrscheinlich nicht das gesamte Spektrum somatischer Mutationen in großen Tumoren. Eine Alternative wäre, mehrere Biopsien für denselben Tumor zu erhalten, aber diese Option scheint weder realistisch noch genau zu sein.
Bei der Flüssigbiopsie werden zirkulierende DNA (ctDNA) und andere Tumornebenprodukte in Blutproben von Krebspatienten gemessen. Dieser neue diagnostische Ansatz verspricht schnelle, nichtinvasive und kosteneffektive Verfahren.
Geschichte der Flüssigbiopsie
Im Jahr 1948 identifizierten zwei französische Forscher Mandel und Métais erstmals ctDNA im Blut gesunder Menschen. Diese Entdeckung war ihrer Zeit voraus und erst Jahrzehnte später wurde die ctDNA weiter erforscht.
Im Jahr 1977 identifizierten Leon und Kollegen erstmals erhöhte Mengen an ctDNA im Blut von Krebspatienten.
1989 identifizierten Stroun und Kollegen neoplastische (d. H. Krebs) Eigenschaften im Blut. Nach diesen Entdeckungen identifizierten mehrere andere Gruppen spezifische Mutationen in Tumorsuppressoren und Onkogenen, Mikrosatelliteninstabilität und DNA-Methylierung, die bewiesen, dass ctDNA durch Tumore in den Kreislauf freigesetzt wird.
Obwohl wir wissen, dass aus Tumorzellen stammende ctDNA im Blut zirkuliert, sind der Ursprung, die Freisetzungsrate und der Mechanismus der Freisetzung dieser DNA unklar, wobei die Forschung zu widersprüchlichen Ergebnissen führt. Einige Forschungsergebnisse legen nahe, dass mehr bösartige Tumore mehr tote Krebszellen enthalten und mehr ctDNA freisetzen. Einige Forschungsergebnisse legen jedoch nahe, dass alle Zellen ctDNA freisetzen. Nichtsdestoweniger scheint es wahrscheinlich, dass krebsartige Tumore erhöhte Mengen an ctDNA in das Blut freisetzen, was die ctDNA zu einem guten Biomarker für Krebs macht.
Wegen der starken Fragmentierung und niedrigen Konzentrationen im Blut ist die ctDNA schwierig zu isolieren und zu analysieren. Es besteht eine Diskrepanz der ctDNA-Konzentrationen zwischen Serum- und Plasmaproben. Es scheint, dass Blutserum anstelle von Blutplasma eine bessere Quelle für ctDNA ist. In einer Studie von Umetani und Kollegen wurde festgestellt, dass ctDNA-Konzentrationen im Plasma im Vergleich zum Serum aufgrund des möglichen Verlusts an zirkulierender DNA während der Reinigung konsistent niedrig sind, da Koagulation und andere Proteine während der Probenpräparation eliminiert werden.
Nach Heitzer und Kollegen sind hier einige spezifische Fragen zu klären, die gelöst werden müssen, um das diagnostische Potenzial von ctDNA zu nutzen:
Erstens müssen präanalytische Verfahren standardisiert werden …. Die Auswahl einer Isolierungsmethode, die die Extraktion einer ausreichenden Menge an qualitativ hochwertiger DNA sicherstellt, ist von entscheidender Bedeutung, und es konnte gezeigt werden, dass präanalytische Faktoren der Blutprobenentnahme und -verarbeitung den DNA-Ertrag stark beeinflussen können …. Zweitens ist eines der wichtigsten Probleme die fehlende Harmonisierung der Quantifizierungsmethoden. Unterschiedliche Quantifizierungsmethoden, … führen zu unterschiedlichen Ergebnissen, da diese Messungen entweder auf totale oder nur auf amplifizierbare DNA abzielen …. Drittens ist weniger über den Ursprung und den detaillierten Mechanismus der ctDNA-Freisetzung bekannt, und in den meisten Studien werden Ereignisse verwechselt, die ebenfalls zur Freisetzung von ctDNA beitragen könnten.
Zielgerichtete vs. nicht zielgerichtete Ansätze
Gegenwärtig gibt es zwei Hauptansätze, die bei der Analyse von Blutplasma (oder Serum) für ctDNA verwendet werden. Der erste Ansatz ist zielgerichtet und sucht nach spezifischen genetischen Veränderungen, die auf Tumore hindeuten. Der zweite Ansatz ist nicht zielgerichtet und beinhaltet eine genomweite Analyse nach ctDNA, die Krebs widerspiegelt. Alternativ wurde die Exom-Sequenzierung als kosteneffektiverer, nicht zielgerichteter Ansatz verwendet. Exomes sind die Teile der DNA, die transkribiert werden, um Protein zu machen.
Mit gezielten Ansätzen wird das Serum auf bekannte genetische Mutationen in einer kleinen Reihe von Mutationen untersucht.
Treibermutationen beziehen sich auf Mutationen im Genom, die das Wachstum von Krebszellen fördern oder "treiben". Zu diesen Mutationen gehören KRAS oder EGFR.
Aufgrund der technologischen Fortschritte der letzten Jahre sind gezielte Ansätze zur Analyse des Genoms für kleine Mengen an ctDNA möglich geworden. Diese Technologien umfassen ARMS (refraktäres Verstärkungsmutationssystem); digitale PCR (dPCR); Perlen, Emulsionen, Verstärkung und Magnetismus (BEAMing); und Tiefensequenzierung (CAPP-Seq). Obwohl es technologische Fortschritte gibt, die den gezielten Ansatz ermöglichen, zielt der zielgerichtete Ansatz nur auf wenige Positionen von Mutationen (Hotspots) und vermisst viele Mutationen wie Tumorsuppressorgene. Der Hauptvorteil von ungezielten Ansätzen zur Flüssigbiopsie besteht darin, dass sie bei allen Patienten verwendet werden können, da der Test nicht auf wiederholten genetischen Veränderungen beruht. Wiederholte genetische Veränderungen decken nicht alle Krebsarten ab und sind keine spezifischen Krebssignaturen. Dennoch fehlt dieser Ansatz analytische Sensitivität und eine umfassende Analyse von Tumorgenomen ist noch nicht möglich. Bemerkenswert ist, dass der Preis für die Sequenzierung eines gesamten Genoms erheblich gesunken ist. Im Jahr 2006 lag der Preis für die Sequenzierung des gesamten Genoms bei etwa 300.000 USD. Bis 2017 waren die Kosten auf etwa 1.000 USD pro Genom gesunken, einschließlich Reagenzien und der Amortisation von Sequenziermaschinen.Klinischer Nutzen der Flüssigkeitsbiopsie
Anfängliche Bemühungen zur Verwendung der ctDNA waren diagnostische und verglichene Werte bei gesunden Patienten mit denen von Krebspatienten oder solchen mit gutartigen Erkrankungen. Die Ergebnisse dieser Bemühungen waren gemischt, wobei nur einige Studien signifikante Unterschiede hinsichtlich Krebs, krankheitsfreiem Status oder Rückfall zeigten.
Der Grund, warum ctDNA nur zeitweise zur Diagnose von Krebs verwendet werden kann, liegt darin, dass variable Mengen an ctDNA aus Tumoren stammen. Nicht alle Tumore "vergießen" DNA in gleicher Menge. Im Allgemeinen wird bei fortgeschritteneren, weit verbreiteten Tumoren mehr DNA in die Zirkulation abgegeben als bei frühen, lokalisierten Tumoren. Darüber hinaus schütten verschiedene Tumortypen unterschiedliche Mengen an DNA in den Blutkreislauf. Der Anteil an zirkulierender DNA, der von einem Tumor stammt, ist in Studien und Krebsarten sehr unterschiedlich und reicht von 0,01% bis 93%. Es ist wichtig anzumerken, dass im Allgemeinen nur eine Minderheit von ctDNA aus dem Tumor stammt, der Rest stammt aus normalem Gewebe.
Zirkulierende DNA könnte als prognostischer Marker für Krankheiten verwendet werden. Circulating DNA könnte verwendet werden, um Veränderungen im Krebs im Laufe der Zeit zu überwachen. Zum Beispiel zeigte eine Studie, dass die Zwei-Jahres-Überlebensrate bei Patienten mit Kolorektalkarzinom (dh die Anzahl der noch lebenden Patienten mindestens zwei Jahre nach der Diagnose mit Kolorektalkarzinom) und die
KRAS
Hotspot-Mutationen 100 Prozent in denen ohne war Hinweise auf entsprechende zirkulierende DNA. Darüber hinaus ist es möglich, dass in naher Zukunft zirkulierende DNA verwendet werden kann, um präkanzeröse Läsionen zu überwachen.
Zirkulierende DNA könnte auch verwendet werden, um die Reaktion auf die Therapie zu überwachen. Da zirkulierende DNA ein besseres Gesamtbild der genetischen Ausstattung von Tumoren bietet, enthält diese DNA wahrscheinlich diagnostische DNA, die anstelle von diagnostischer DNA verwendet werden kann, die von Tumoren selbst erhalten wird.
Betrachten wir nun einige spezifische Beispiele der Flüssigbiopsie.
Guardant360 Guardant Health hat einen Test entwickelt, der mithilfe der Next-Generation-Sequenzierung zirkulierende DNA für Mutationen und chromosomale Umlagerungen von 73 krebsbezogenen Genen beschreibt. Guardant Health veröffentlichte eine Studie, die den Nutzen der Flüssigbiopsie in der Onkologie aufzeigt. Die Studie verwendete Blutproben von 15.000 Patienten mit insgesamt 50 Tumorarten. Die Ergebnisse des Flüssigbiopsie-Tests stimmten zum größten Teil mit Genveränderungen überein, die in Tumorbiopsien beobachtet wurden.
Laut NIH:
Guardant360 identifiziert die gleichen kritischen Mutationen in wichtigen Krebs-verwandten Genen wie
EGFR, BRAF,
KRAS
und
PIK3CA
bei Frequenzen, die sehr ähnlich denen waren, die zuvor in Tumorbiopsieproben identifiziert worden waren, statistisch korreliert mit 94% bis 99%. Darüber hinaus berichteten die Forscher laut NIH: In einer zweiten Komponente der Studie beurteilten die Forscher fast 400 Patienten – von denen die meisten Lungen- oder Darmkrebs hatten -, die sowohl Blut-ctDNA- als auch Tumorgewebe-DNA-Ergebnisse zur Verfügung hatten verglichen die Muster der genomischen Veränderungen. Die Gesamtgenauigkeit der Flüssigbiopsie im Vergleich zu den Ergebnissen der Tumorbiopsieanalysen betrug 87%. Die Genauigkeit stieg auf 98%, wenn die Blut- und Tumorproben innerhalb von 6 Monaten gesammelt wurden.Guardant360 war korrekt, obwohl die zirkulierende DNA im Blut niedrig war. Häufig zirkulierende Tumor-DNA machte nur 0,4 Prozent der DNA im Blut aus. Insgesamt konnten die Guardant-Forscher mit Hilfe der Biopsie bei 67 Prozent Tumormarker identifizieren, die bei 67 Prozent der Patienten eine medikamentöse Behandlung veranlassen könnten. Diese Patienten waren sowohl für von der FDA genehmigte Behandlungen als auch für klinische Studien zugelassen. ctDNA und Lungenkrebs
Im Jahr 2016 hat die FDA den cobas EGFR Mutationstest für den Nachweis von
EGFR
-Mutationen in der zirkulierenden DNA von Patienten mit Lungenkrebs zugelassen. Dieser Test war die erste von der FDA zugelassene Flüssigkeitsbiopsie und identifizierte Patienten, die Kandidaten für eine Behandlung mit gezielten Therapien unter Verwendung von Erlotinib (Tarceva), Afatinib (Gilotrif) und Gefitinib (Iressa) als Erstlinientherapie und Osimeritinib (Tagrisso) als Kandidaten sein könnten Zweitlinientherapie. Diese gezielten Therapien greifen Krebszellen mit spezifischen
EGFR
-Mutationen an.
Aufgrund der hohen Anzahl falsch-negativer Ergebnisse empfiehlt die FDA, dass eine Gewebebiopsieprobe auch von einem Patienten mit einer negativen Flüssigkeitsbiopsie entnommen werden sollte.ctDNA und LeberkrebsDie Zahl der an Leberkrebs gestorbenen Menschen hat in den letzten 20 Jahren zugenommen. Derzeit ist Leberkrebs die zweithäufigste Ursache für Krebstod in der Welt. Es gibt keine guten Biomarker, um Leber- oder hepatozellulären (HCC) Krebs zu erkennen und zu analysieren. Zirkulierende DNA könnte ein guter Biomarker für Leberkrebs sein. Betrachten Sie das folgende Zitat von Lagbaa und Co-Autoren über das Potenzial der Verwendung zirkulierender DNA zur Diagnose von Leberkrebs: Hypermethylierung von RASSF1A, p15 und p16 wurden als frühe diagnostische Werkzeuge in einer retrospektiven Studie mit 50 HCC-Patienten vorgeschlagen. Eine Signatur von vier aberrant methylierten Genen (APC, GSTP1, RASSF1A und SFRP1) wurde ebenfalls auf diagnostische Genauigkeit getestet, während die Methylierung von RASSF1A als prognostischer Biomarker berichtet wurde. Nachfolgende Studien analysierten die ctDNA bei HCC-Patienten mit Deep-Sequencing-Technologien … Bemerkenswerterweise wurden bei zwei HBV-Trägern, die zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine HCC hatten, aberrante DNA-Kopien nachgewiesen, die jedoch während der Nachbeobachtung HCC entwickelten. Dieser Befund öffnete die Tür, um die Kopienzahlvariation in der ctDNA als ein Screening-Werkzeug für die frühe HCC-Detektion zu bewerten.
Ein Wort von Verywell
Flüssigbiopsien sind ein spannender neuer Ansatz in der Genomdiagnostik. Gegenwärtig sind bestimmte flüssige Biopsien, die ein umfassendes molekulares Profiling bieten, Ärzten verfügbar, um genetische Information, die aus einer Gewebebiopsie erhalten wird, zu ergänzen. Es gibt auch bestimmte flüssige Biopsien, die anstelle einer Gewebebiopsie verwendet werden können, wenn Gewebebiopsien nicht verfügbar sind.
Es ist wichtig zu bedenken, dass derzeit viele liquide Biopsiestudien laufen und mehr Forschung betrieben werden muss, um den therapeutischen Nutzen dieser Intervention zu konkretisieren.
